类胡萝卜素通过影响淀粉体膜完整性调节玉米籽粒质地

期刊：NatureCommunications

发表时间：.10

IF：12.

年10月22日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心巫永睿团队在NatureCommunications在线发表了题为”Carotenoidsmodulatekerneltextureinmaizebyinfluencingamyloplastenvelopeintegrity“的研究论文。本研究通过遗传学，转录组、代谢组学深入解析了类胡萝卜素成分改变影响玉米硬质胚乳形成的分子遗传机制，为培育高β-胡萝卜素、硬质的优良品种奠定基础。迈维代谢提供了类胡萝卜素检测和脂质检测分析服务。

玉米籽粒质地是一个非常重要的农艺性状，它由硬质胚乳和粉质胚乳的比例所决定。影响醇溶蛋白合成，蛋白体形成以及淀粉合成的突变体就会导致籽粒硬粉质改变。尽管已鉴定出影响玉米醇溶蛋白和淀粉合成的大量突变，并提供了对形成硬质胚乳机制的深入了解，但对数量性状位点及其代谢产物的了解却很少。本研究克隆了控制玉米籽粒质地的主效QTLVen1，该基因通过调节β-胡萝卜素含量影响籽粒质地。高水平的β-胡萝卜素可以阻止淀粉体膜破裂，并影响干燥胚乳细胞中脂质的数量和组成。这会破坏SG（淀粉粒）和PB（蛋白体）之间的相互作用，形成空间阻隔，并因此导致成熟胚乳的粉质特性。

1、基因克隆功能验证-BSA测序，遗传定位，RNA干扰：Ven1是控制玉米籽粒质地的主效位点

材料W64A和A在玉米胚乳硬度上存在差异（图1a-d)。W64A籽粒包含80%的硬质胚乳，而A仅含有20%硬质胚乳（图1c,d）。在灯箱上，观察到W64A的透光性，而A则没有（图1b）。扫描电子显微镜（SEM）显示，W64A胚乳的硬质区域包含嵌入蛋白质基质中的淀粉粒，但是这种基质在A中不明显，后者具有松散的淀粉粒（图1c）。

作者使用A与W64A和另外两个硬质胚乳自交系D和P25进行杂交，发现所有F1杂种均为硬质胚乳，表明控制A（Ven1A）中粉质胚乳表型的位点是隐性的。玉米籽粒质地是一个复杂的性状，受许多遗传和非遗传因素的影响。为了克隆Ven1，作者通过回交将优势Ven1W64A等位基因连续渗入A背景来创建群体。在F1BC7中，具有硬质和粉质表型的种子通过自花传粉繁殖了两代，产生了纯合的近等基因系（NILs）NILW64A和NILA。

作者通过收集A与W64A杂交的F1BC5群体中分离的硬质和粉质胚乳种子，进行了混池（BSA）测序。结果表明只有一个候选区域位于10号染色体上（图1e）。并通过群体定位QTL区间缩小到0.2Mb区域（图1f），包含五个基因。RNA-seq分析显示，W64A和NILW64A中只有Zmd与A和NILA差异表达。其他四个基因在这些品系的胚乳中以相似的水平表达或以低水平表达（图1g）。作者对该基因以及基因上下游1.2kb区域进行了克隆，发现Ven1A等位基因在3端含有一个bp的缺失，导致Ven1A蛋白被截短。并且Ven1A也与由A与D和P25杂交的F1BC4群体中的粉质表型有关。与W64A和NILW64A相比，在A和NILA中几乎检测不到VEN1蛋白（图1h），表明Ven1A是一个无功能的等位基因。

为了确认该突变是造成A粉质胚乳表型的原因，作者使用了RNA干扰（RNAi）技术来敲除KN中Ven1的表达。结果表明Zmd是控制A中粉质胚乳表型的基因。

图1：Ven1的图位克隆和遗传验证。a、W64A,A,NILW64A和NILA的穗表型。b、灯箱下观察的籽粒硬质程度。c、W64A,A,NILW64A和NILA籽粒的横截面。d、籽粒横截面中硬质胚乳面积的测量。e、通过测序定位Ven1。f、Ven1的精细定位。g、候选基因在两个亲本和两个NIL的18-DAP胚乳中的表达水平。h、种子中VEN1的免疫印迹分析。i、在两个独立的转基因品系中对Ven1进行qRT-PCR分析。j、VEN1在两个独立转基因系的18-DAP胚乳中的免疫印迹分析。k、自花授粉的Ven1RNAi/+穗中硬质胚乳的分离。l、NILW64AxVen1RNAi/+的穗的表型。

2、类胡萝卜素含量测定-液相色谱质谱联用：Ven1A导致非极性类胡萝卜素的过度积累

定量RT-PCR显示，Ven1在W64A胚乳中高表达，其中RNA转录水平在12DAP后逐渐增加，在35DAP时达到峰值（图2a）。RNA原位杂交表明，Ven1主要在从顶部到籽粒中心的淀粉状胚乳细胞中表达（图2b）。蛋白定位结果表明，VEN1的分布被限制在胚乳细胞的淀粉体膜内部（图2d–f）。

Ven1编码β-胡萝卜素羟化酶3（HYD3），其使α-/β-胡萝卜素的β-紫罗兰酮环羟基化，产生叶黄素（例如叶黄素和玉米黄质）。作者测量了24和35DAP胚乳中的总类胡萝卜素含量，发现NILW64A和NILA之间的总类胡萝卜素含量没有明显差异。然而，作者发现，在HYD3上游产生的非极性类胡萝卜素，例如八氢番茄红素，番茄红素，α-胡萝卜素和β-胡萝卜素，在NILA中的蓄积水平明显高于NILW64A，而HYD3下游的叶黄素和玉米黄质则相反。

图2：种子发育过程中Ven1的转录本和蛋白质表达模式。a、种子发育过程中Ven1的RT-qPCR分析。b、18-DAP种子中Ven1的RNA原位杂交。c、在本氏烟草叶绿体中VEN1-GFP的亚细胞定位。d、通过免疫荧光在胚乳淀粉细胞中定位VEN1。e、VEN1在平面SG上的环状定位。f、通过Z-stack成像将VEN1蛋白定位在三维SG表面上。

3、硬质胚乳形成机制-SEM和TEM观察SG和PB的发育：Ven1A影响SG-PB相互作用

为了研究Ven1A影响硬质胚乳形成的机制，作者首先检查了玉米醇溶蛋白的合成。发现A累积的玉米醇溶蛋白水平明显低于W64A。因此，玉米醇溶蛋白的不足积累可能导致PB数量和大小的减少，进而导致A的粉质表型。然而，结果表明玉米醇溶蛋白水平与胚乳质地无关。然后检查了NILW64A和NILA中的淀粉合成，发现所有淀粉合成基因的表达，以及总淀粉和直链淀粉含量在两个材料中没有明显差异。

因为Ven1似乎对玉米醇溶蛋白和淀粉合成没有直接影响，所以作者研究了Ven1A如何影响PB和SG的发育以及随后的相互作用。在第24DAP时，TEM（透射电镜）显示SGs和PBs正常发育，并且在NILW64A和NILA之间没有显示大小和数量上的明显差异。当通过SEM检查胚乳细胞时，作者发现NILW64A中的SG被PB紧密地包围，似乎被嵌入蛋白质的细胞骨架中。相比之下，NILA中的SG附着着明显更少的PB，它们在SG表面上显示出不均等的分布。30DAP的TEM显示NILW64A胚乳细胞中的PBs越来越多地聚集在SG周围，而在NILA中，PB随机分布在SG之间。当通过SEM观察时，NILW64A中的SG被嵌入PB和细胞质的致密基质中。可能由于紧密压实，SGs开始形成多边形。在NILA中，大多数SG与少量的PB接触，并且它们保持其球形形态。35DAP是硬胚乳形成的关键时间点。到那时，大多数淀粉胚乳细胞都经历了程序性的细胞死亡，贮藏代谢产物的合成减慢，水分迅速减少，胚乳进入蜡熟期。

在NILW64A中，TEM显示所有PB汇聚在一起，从而在SG周围创建了一个连续的矩阵网格。每一个蛋白基质网格紧密包埋着一颗淀粉粒，形成硬质胚乳的基本单元；后来形成的硬质胚乳由许多这样的相互连接的单元组成。相反，在NILA中未形成这种网格结构。在SEM中，观察到NILW64A中的SG和PB紧密缝合在一起，具有硬质胚乳形成的特征，而NILA中的SG和PB则松散地堆积着,并在它们之间形成空隙，这是粉质胚乳的典型特征。这些结果表明，在NILA胚乳的干燥过程中，PB和SG的压实受到影响。

4、淀粉体膜完整性和脂质组成研究-TEM观察和脂质测定：Ven1A影响淀粉体膜的完整性和脂质组成

为了研究NIL-Ven1A干燥过程中SG和PB相互作用的过程，作者通过TEM以更高分辨率检查了细胞器。淀粉质体是用于淀粉合成的特殊质体，并被两个脂蛋白膜所包围。在18DAP时，当NILW64A中的SG进行快速发育时，作者观察到淀粉体膜是完整的，表明它们可用于淀粉合成（图3a）。在24DAP时，当NILW64A中的许多SG达到成熟时，淀粉体膜开始破裂，这可以由其周围的碎屑所证实（图3b）。由于SGs在此阶段的成熟度不同，因此还观察到了那些具有完整或完全降解膜的SGs。在35DAP时，NILW64A中的淀粉体膜完全消失，使PB与SG发生物理相互作用（图3c）。PBs是通过不确定的细胞质成分通过疏水相互作用而被拉在一起的（图3d）。相比之下，NILA中的淀粉体膜表现不同。在18DAP时，膜似乎不规则地膨胀，导致形成无定形结构（图3e）。NILA中的膜似乎更持久。它们在24DAP时完好无损（图3f），在35DAP时完好无损（图3g）。膜的稳定性似乎形成了屏障，阻止了PB和细胞质基质接近SG。与NILW64A相比，PB周围几乎没有密集的细胞质内容物（图3h）。这些结果表明，Ven1A某种程度上影响了淀粉体膜的破坏，这对于SG-PB相互作用至关重要。

分离的淀粉体膜含有约70％的半乳糖脂和25％的磷脂（PL），但没有甘油三酯（TAG）和脂肪酸（FA）这样的中性脂质。单半乳糖基-二酰基甘油（MGDG）和双半乳糖基-二酰基甘油（DGDG）提供了淀粉体的结构和功能组织。作者在24和35DAP时测量了胚乳中脂质的数量和组成，发现它们在NILA和NILW64A之间有显著差异。在胚乳中，主要存在中性脂质，例如FA和TAG。在每个NIL中，总脂质含量在两个时间点没有明显改变，但在NILA中它始终显著高于NILW64A（图3i），表明脂质合成能力增强。在第24DAP时，当许多SG的淀粉体膜开始在NILW64A中分解时，只有少数极性脂质（PA，LPC和LPE）在NILA中的蓄积水平要比NILW64A更高（图3j，k）。这表明尽管在NILW64A中发生了淀粉体膜的破坏，但主要脂质，如半乳糖脂仍存在胚乳细胞中。两个NIL之间的明显差异是FA和TAG的含量。在35DAP，当大多数SG的淀粉体膜在NILW64A中完全降解时，NILA中淀粉体膜中主要的半乳糖脂DGDG的含量，以及PL（PC，PE，PG）和lysoPL（LPC，LPE，LPG）的含量显著高于NILW64A（图3k）。与两个NIL中24DAP相比，在35DAP时，淀粉质体脂质，MGDG，DGDG和其他膜磷脂（PA，PC，PE和PG）的含量降低了。在这个阶段，尽管TAG并没有明显的差异，但FA和二酰基甘油酯（DAG，次要的中性脂质成分）在NILA中明显高于NILW64A。NILW64A和NILA之间的脂质组成差异与淀粉体膜的完整性的差异状态一致（图3b，c，f和g）。

图3：NILs的胚乳中PB膜的稳定性和脂质组成的变化。a、18DAP时NILW64A胚乳细胞。b、24DAP时NILW64A胚乳细胞。c、35DAPNILW64A胚乳细胞。d、在35DAP时NILW64A中PB和脂质体样结构的紧密堆积。e、18DAP时NILA的胚乳细胞。f、24DAP时NILA胚乳细胞。g、35DAP时NILA胚乳细胞。h、35DAP时，NILA中PB的松散包装i、24和35DAP时NIL胚乳中的总脂质含量。j–k、24和35DAP时NIL胚乳中半乳糖脂j和磷脂k的含量。

5、类胡萝卜素合成对A粉质表型的影响-EMS诱变：上游类胡萝卜素生物合成途径上位于Ven1A表型

为了进一步研究A中非极性类胡萝卜素的过度积累是否与粉质胚乳表型有关，作者用甲基磺酸乙酯（EMS）处理了A，并通过观察胚乳颜色筛选了类胡萝卜素合成有缺陷的突变体。作者鉴定了四个单基因隐性突变体，它们在胚乳颜色上显示出不同的差异，表明这些突变发生在类胡萝卜素合成的不同步骤中（图4a-e）。这些突变体的共同特征是粉质转化为硬质胚乳表型。并将其命名为ves1，ves2，ves3-1和ves3-2，最后两个是等位基因突变（图4f–g）。作者测量了类胡萝卜素的组成，发现在所有这些突变体中番茄红素，α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的合成均被抑制（图4h），证实了非极性类胡萝卜素的过度积累与A胚乳中的粉质表型密切相关。然后，作者通过BSA测序克隆了这些基因。Ves1编码4-hydroxyphenylpyruvatedioxygenase1（HPPD），这是植物体内醌和生育酚合成的第一步，并在功能上逆转拟南芥中的pds1突变表型。Ves2（也称为种子类胡萝卜素缺陷型，Scd）编码hydroxymethylbutenyldiphosphatesynthase（HDS）。Ves3编码1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatesynthase（DXS），位于VES2的上游。测序表明，ves1、2和3-1是由第二个外显子的提前终止密码子引起的，而ves3-2是DXS的错义突变，其中Arg-变为Trp。与A中持续存在的淀粉体膜相反，TEM显示在30DAP时ves1、2、3-1和3-2的胚乳细胞中的淀粉体膜完全降解，这使PB聚集在SG周围（图4i）。SEM显示，突变体胚乳中的SG均被PB和细胞质内容物紧密压实（图4j）。这些结果在遗传学上支持上游类胡萝卜素生物合成途径上位于Ven1A表型。

图4：Ven1A抑制子筛选。a、A穗子；b–eves1（b），ves2（c），ves3-1（d）和ves3-2（e）基因突变的穗子。f、在灯箱上观察到的A和抑制子的硬质性。g、A和抑制子的籽粒横截面。h、A，抑制子和NILW64A的胚乳组织中的类胡萝卜素组成发生了变化。i、在30DAP时对A和抑制子胚乳的TEM。j、30DAP时A和抑制子胚乳细胞的SEM。

6、筛选Ven1A胚乳修饰因子-GWAS分析：9个基因可能是潜在的修饰因子

在VenW64A导入A期间，直到F1BC3才观察到粉质表型的分离。作者分析了个近交系的Ven1基因型，发现14个带有Ven1A等位基因，成熟籽粒中12个是硬质胚乳，只有两个具有粉质胚乳，表明自然群体中存在影响粉质胚乳表型的遗传修饰因子。为了鉴定自然种群中的Ven1A修饰子，作者通过与Ven1RNAi/+杂交来筛选个品系，鉴定出自然种群中不同程度的表型修饰，其中个被完全修饰，35个被部分修饰和45个完全未被修饰。每种修释的示例如图5a-c所示。这些数据表明，自然种群中很大比例的种质（30％）由于修饰不完全而不适用于原维生素A的生物强化，而Ven1A是罕见的等位基因，具有增加玉米籽粒中β-胡萝卜素的潜力。

针对修饰子的全基因组关联研究（GWAS）确定了分布在1号，3号，6号和8号染色体上的六个明显峰（P=5×10-8）（图5d）。遗传变异和W64A和A胚乳18DAP的RNA-seq转录组分析显示，这些区域中的9个基因在W64A中表达高，而在A中表达低。其中，Gst1催化谷胱甘肽（GSH；γ-Glu-Cys-Gly）与亲电子化合物（如ROS和GSH）结合，成为氧化形式，即谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。因此，Gst1的较高表达可能会改变胚乳细胞中的氧化还原状态，这可能继而影响硬质胚乳形成过程中的淀粉体膜的稳定性和SG-PB相互作用。

图5：通过GWAS筛选Ven1A胚乳修饰因子并提出硬质胚乳形成的模型。a–c被Ven1RNAi/+授粉后显示出完全修饰（a），部分修饰（b）和完全未修饰（c）的穗子表型。d、胚乳是否包含Ven1A修饰因子的Manhattan图。e、硬质胚乳形成的模型。

研究目的：解析类胡萝卜素成分改变影响玉米硬质胚乳形成的分子遗传机制，为培育高β-胡萝卜素、硬质的优良品种奠定基础。

研究结论：高含量的β-胡萝卜素可以阻止淀粉体膜破裂，影响胚乳细胞中脂质的数量和组成。破坏SG和PB之间的互作，并最终导致成熟胚乳的粉质特性。

锦上添花：自然群体中存在Ven1A的修饰因子，通过GWAS关联分析，作者初步鉴定了基因组中修饰因子的分布位点，期待作者后续的研究成果。

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