在药物前期开发过程中，使用酶活抑制实验技术筛选化合物库经常会出现假阳性结果。据统计，85%-95%的假阳性结果可归咎于小分子在溶液中聚集形成胶体，靶蛋白被所形成的胶体吸附，造成非特异性的活性抑制。但是，小分子聚集形成胶体也不是毫无用处，其可运用在蛋白纯化中分离特定蛋白，也有用于药物传递的潜力。因此，进一步了解溶液相中小分子配体聚集对靶蛋白影响的作用机制，有助于在药物研发中更好的利用这一性质。
在前人的研究下，有三种小分子配体聚集形成的胶体对靶蛋白催化活性影响的作用机制被提出，如图1所示。分别是（a）胶体与蛋白表面接触，诱导蛋白错误折叠，降低催化活性；（b）胶体与蛋白表面接触，改变蛋白的动力学行为，阻碍靶蛋白发生作用；（c）所形成的胶体堵住了蛋白结合口袋，阻碍了底物结合。近日，来自阿布扎比AlAin大学的Mohammad.A.Ghattas课题组，通过微秒级时长的分子动力学模拟，研究了咪康唑胶体存在下β-内酰胺酶以及蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）两种蛋白的变化，其计算结果更加支持c机制，相关研究内容发表于美国化学会出版的化学信息学核心期刊JournalofChemicalInformationandModeling杂志上（DOI:10./acs.jcim.0c）。
图-1小分子化合物聚集形成胶体造成非特异性抑制的三种机理
作者进行分子动力学模拟的流程简述如下：首先使用AMBER中xleap模块构建了咪康唑分子的聚集体，考虑到咪康唑存在一个手性中心，该聚集体中R构型、S构型均存在。将聚集体置于一八面体的水盒子中，经过ns的动力学模拟后，使用cpptraj中封装的DBSCAN方法进行聚类分析，聚类结果占比最大、排名最高的一类作为后续构建咪康唑聚集体-酶体系的基础；随后，作者分别挑选了β-内酰胺酶、PTP1B两种蛋白的晶体结构（PDBID分别为1ZG4、5K9V），经MOE的蛋白处理模块处理后，相对于咪康唑聚集体，分别取了6个不同朝向作为体系初始构象，蛋白和聚集体的最近距离在15到26?之间（见图-2）。为了进行对比，也单独将不存在咪康唑聚集体的1ZG4和5K9V两个蛋白结构进行了分子动力学模拟。以上提到的所有模拟，蛋白使用FF14SB力场，咪康唑使用GAFF力场，体系平衡后模拟时长均为1微秒。
图-2β-内酰胺酶（a图中的黄色飘带）与PTP1B蛋白（b图中的绿色飘带）相对于咪康唑聚集体的6种初始取向
获得MD轨迹后，为验证机制a——小分子聚集体是否造成了靶蛋白三级结构的改变，作者计算了模拟过程中蛋白骨架RMSD变化，发现对于β-内酰胺蛋白而言，与咪康唑聚集体接触的蛋白其骨架的RMSD与无咪康唑分子存在情况下的蛋白相比没有明显区别；对于PTP1B蛋白而言，仅有初始取向为3的轨迹RMSD略高，但蛋白二级结构组成变化情况与自由状态下的PTP1B蛋白无明显差异。这一结果说明对于这两个体系，机制a并不是导致蛋白活性被抑制的主要原因。
图-3β-内酰胺酶（a）和PTP1B蛋白（b）在0ns的动力学模拟中蛋白骨架的RMSD变化。RMSD原始值展示为连续点线，平均值展示为实线。不同颜色与图2中初始取向相对应，取向#1-红色，取向#2-黄色，取向#3-紫罗兰色，取向#4-青绿色，取向#5-橙色，取向#6-绿色，黑色为无咪康唑分子存在情况下的靶蛋白。
目光移向机制b，药物分子聚集体也可能对靶蛋白的动力学性质有较大影响，作者采用模拟后ns的每个残基的均方根涨落（RMSF）衡量蛋白动力学性质改变程度。从图-4上看，相较于自由状态的β-内酰胺酶与PTP1B蛋白，被聚集体吸附的靶蛋白并未表现出RMSF上显著的差别。考察与靶蛋白催化功能有关的关键残基，β-内酰胺酶的Ser70、Lys73、Glu残基以及Ω-环区处残基（残基-），其并没有表现出与自由状态下相比显著不同的动力学行为；PTP1B蛋白，其关键催化位点WPD-环区（残基-）中的残基也并未表现得与自由状态靶蛋白不同。因此，也排除了机制b。
图-4β-内酰胺酶（a）和PTP1B蛋白（b）最后ns的动力学模拟中每个残基的RMSF变化。不同颜色与图2中初始取向相对应，取向#1-红色，取向#2-黄色，取向#3-紫罗兰色，取向#4-青绿色，取向#5-橙色，取向#6-绿色，黑色为无咪康唑分子存在情况下的靶蛋白。
所有的12条轨迹在ns后，靶蛋白与咪康唑聚集体均自发的形成了“复合物”，作者猜测药物分子聚集形成的胶体，可能是通过机制c活性位点发生阻塞致使靶蛋白活性被抑制。取轨迹后ns，按重原子RMSD值进行聚类，最主要的类中β-内酰胺酶和PTP1B蛋白活性位点附近均不存在单独的咪康唑分子，仅在少部分情况下咪康唑分子占据了活性口袋；同时作者发现，尽管没有任何一个初始构象中酶活性位点被咪康唑聚集体阻挡，但随着模拟时间的拉长，靶蛋白会被咪康唑聚集体吸附，其结合口袋将被包覆，阻碍底物进入。作者猜想这是由于咪康唑聚集体能与蛋白表面发生多组极性或非极性相互作用，随后作者提高了咪康唑密度，再次进行动力学模拟。随着体系内咪康唑密度增加，更多的咪康唑分子聚集体与蛋白表面结合，β-内酰胺酶被三团独立的咪康唑聚集体吸附，而PTP1B蛋白被半包埋进咪康唑聚集体中，如图-5所示。
图-5增加咪康唑密度后，1微秒MD轨迹中最后ns中聚类分析中最主要类的构象，（a）β-内酰胺酶和（b）PTP1B蛋白
综上所述，作者通过分子动力学模拟咪康唑聚集体吸附β-内酰胺酶、PTP1B蛋白的过程，发现两个靶蛋白活性被抑制的最可能机制是咪康唑聚集形成的胶束在物理空间上阻挡了靶蛋白活性位点。作者猜测，这是由于咪康唑分子具有两亲性，发生聚集后能与蛋白表面发生多组极性相互作用以及非极性相互作用，促使蛋白被咪康唑聚集体吸附包埋。尽管作者工作仅探究两个具体例子，很难说明该机制是否具有普适性，但该工作展现了分子动力学模拟在探究实验手段难以观测的现象时的优越性。增加咪康唑密度，在模拟中PTP1B蛋白发生半包埋，也表明小分子聚集形成胶体在药物递送上具有一定应用潜力。
参考文献
(1)Feng,B.Y.;Simeonov,A.;Jadhav,A.;Babaoglu,K.;Inglese,J.;Shoichet,B.K.;Austin,C.P.AHigh-ThroughputScreenforAggregation-BasedInhibitioninaLargeCompoundLibrary.J.Med.Chem.,50(10),–.
(2)Ghattas,M.A.;AlRawashdeh,S.;Atatreh,N.;Bryce,R.A.HowDoSmallMoleculeAggregatesInhibitEnzymeActivity?AMolecularDynamicsStudy.J.Chem.Inf.Model.,60(8),–.
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